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转Bt水稻Bt-SY63及其微生物多样化对臭氧浓度升高响应

  • 发布日期:2015-06-04
  • 责任编辑:lgg
  • 论文字数:36258
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  • 论文编号:fb201506031243019787
  • 论文类型:硕士毕业论文
  • 论文价格:150

第一章 文献综述


1.1 近地层臭氧浓度升高及其对植物形态结构、生理生化的影响
大气平流层中的微量臭氧(O3)可以有效吸收太阳辐射中对地表生物具有潜在危害的紫外B波(285~315 nm),在保护地球生命过程中扮演着重要角色。然而,高浓度的近地表O3却是大气光化学污染物的主要成分,伴随着近现代工业技术的兴起,化石燃料的过度燃烧、汽车尾气、建筑印刷等行业的高速发展将越来越多的N氧化物(NOX)、挥发性有机化合物(VOC)排放到大气环境中,这些化合物在强光照射、高温等条件下发生反应形成O3(Ryerson et al.,2001)。近年来,近地层臭氧浓度背景值以每年0.5%到2.5%的速度递增,本世纪初全球陆地上空近地层的臭氧平均浓度已达到60nL L-1,远超过了敏感植物包括主要农作物臭氧损伤的40nL L-1的阀值,而东亚地区特别是我国的中东部,臭氧浓度增幅更大,预计2030年前后,臭氧浓度将增加50%左右(Vingarzan,2004;Ashmore etal.,2004;IPCC,2007;李莉,2008;Emberson et al.,2009)。高浓度臭氧对植物的形态结构、生理生化、生物量和产量等都造成不同程度的损伤,美国每年因农作物遭臭氧等光化学烟雾污染而造成的损失达上百亿美元,臭氧烟雾对农作物的损害,每年使欧洲农业损失约60亿欧元。我国水稻和小麦的产量损失到2020年前后预计将达到10%和40%左右(Ashmore,2005;Feng et al.,2003;Feng et al.,2009;Wang et al.,2007)。浓度逐渐增高的臭氧在成为东亚乃至世界范围大气最重要的污染物之一的同时,它对植物及由此产生的连锁影响亦成当今世界科学家及公众密切关注的重要问题。
……….


1.2 近地层臭氧浓度升高对植物基因表达的影响
以前臭氧胁迫的分子生理研究主要集中在通过高通量组学来比较植物细胞分子变化,当前的研究则主要集中在基因与蛋白的表达和调控方面,特别是与细胞排毒、抗氧化防御能力相关的酶和已知编码这些酶的关键基因的研究。臭氧诱导了基因表达的深层变化。在臭氧胁迫下植物基因表达的调控发生改变,如在关于拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型的臭氧熏气实验中发现,与自然大气的对照只有 58 个基因上调和 577 个基因下调的转录本相比,在臭氧的影响下拟南芥生态型各有 400 个转录本上调和 800 个转录本下调(Miyazaki et al.,2004)。Cho等(2013)对臭氧胁迫下水稻的圆锥花序和谷粒通过高通量低聚糖 DNA 微阵列技术进行研究后发现,臭氧胁迫分别使圆锥花序的 177 个基因上调和 444 个基因下调,谷粒的 24 个基因上调和 106 个基因下调,其中,差异表达的基因主要参与水稻的信号传递、激素、转录、蛋白质水解和防御过程,还发现了许多对臭氧敏感的新基因,如编码钙依赖蛋白激酶、磷脂酰肌醇激酶、G-蛋白组件和细胞壁相关蛋白激酶等的基因。通过研究发现在臭氧影响下,三碳(C3)植物的各种酶,如 Rubisco (Pelloux et al.,2001;Dizengremel et al.,2009)、PEPC(Dizengremelet al.,2009)等酶的活性和数量改变,蛋白受到调控。此外,Short 等人(2012)证实了拟南芥对臭氧胁迫响应的基因表达中依赖钙离子(Ca2+)的变化不只是活性氧诱导的(Ca2+)cyt本身增加的结果,随着臭氧浓度和时间的变化,过氧化氢和钙离子均显著改变。这一发现符合在植物体内复杂钙离子信号的时空动态下,特定刺激的转录信息也可以被编码的假设。另外,Markus 等用臭氧处理桦树后得到了一个 1.3 kb 的与植株的抗臭氧性状相关的 cDNA 片段。
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第二章Bt-SY63及SY63水稻组织生理对臭氧浓度升高的响应


2.1 材料与方法
试验地位于江苏省江都市小纪镇良种场(119°42′0″E,32°35′5″N)的中国O3-FACE(Ozone Free Air Controlled Enrichment)系统研究平台,该地耕作方式为水稻-冬小麦复种,是典型的稻麦复种农田生态系统。该地年均降水量 980mm左右,潜在年蒸发量>1100mm,年平均温度 14.9℃,年日照时间>2100h,年无霜期 220d。试验用土取自育秧田表层(0~20cm)土壤。土壤类型为砂浆水稻土,理化性质:容重为 1.2g•cm-3,有机质含量 17.42g•kg-1,全氮 1.59g•kg-1,全磷 1.23g•kg-1,有效磷 10.4 mg•kg-1,全钾 14.02 g•kg-1,pH 6.8。O3-FACE 平台于 2007 年 3 月开始运行,试验平台设有 3 个 O3处理圈(ElevatedO3)和 3 个对照圈(Ambient O3)。Elevated-O3圈设计为直径 14m 的正八面形,Elevated O3圈与 Ambient O3圈之间间隔大于 70m,以减少 O3释放对 Ambient O3圈的影响。通过围成正八角形的 8 根橡胶管带上直径 0.5 mm×0.9 mm 的小孔在作物冠层上方 50~60 cm 向圈中心喷射 O3气体,晴天每天 09:00~18:00 释放 O3,电脑控制使 Elevated O3圈内 O3浓度始终保持在 Ambient 的 1.5 倍,控制误差为10%。对照田块没有安装管道,环境条件与自然状态完全一致。2010 年 ElevatedO3圈布气时间为 7.2~10.8,2011 年布气时间为 6.27~10.20。试验期间O3圈和 Ambient O3圈的 O3浓度变化见图 2-1.
………..


2.2 结果与分析
表 2-1 的广义线性模型的重复测量方差表明,纵观整个生长时期,两品种间的叶片长度和叶片面积存在着显著差异(P<0.05)而叶片宽度没有显著差异。综合 Ambient 和 O3升高两种臭氧条件 Bt-SY63 整个生长时期的平均叶片长度和平均叶片面积均比 SY63(P<0.05)小。叶片长度还存在着显著的时间(生长时期)效应(P<0.05),即随着叶片的衰老,叶片长度显著减少,而叶片宽度和叶面积没有显著的时间效应 (p>0.05)。O3处理没有使叶片长度、叶片宽度和叶面积发生显著变化(p>0.05)。O3处理与品种间的交互作用、时间与 O3处理的交互作用、时间与品种的交互作用、时间与 O3处理及品种三者之间的交互作用对叶片长度、叶片宽度和叶面积均没有显著影响(p>0.05)。
…………


第三章 臭氧浓度升高下 Bt-SY63 水稻中 Bt 基因........42
3.1 材料与方法......42
3.2 结果与分析......45
3.2.1 臭氧浓度升高下水稻各组织中 Bt 蛋白含量变化.........45
3.2.2 水稻叶片总 RNA 的质量检测分析 ......48
3.2.3 实时荧光定量 PCR 分析 ....51
3.3 讨论......54
第四章 臭氧浓度升高对 Bt-SY63 及 SY63 水稻的土壤.......57
4.1 材料与方法 .........57
4.2 结果与分析 .........60
4.3 讨论.....77
第五章 臭氧浓度升高对 Bt-SY63 及 SY63 水稻的土壤微生物.....82
5.1 材料与方法 .........82
5.1.1 试验地及 O3-FACE 系统 ........82
5.1.2 试验材料及育苗.........82
5.1.3 土壤样品采集 ......82
5.2 结果与分析 .........83
5.3 讨论 .....94


第七章 臭氧浓度升高对 Bt-SY63及 SY63水稻的叶面微生物群落功能多样性的影响


叶面微生物群落作为生态系统中极重要的一环,对植物的生长、植物抗性、生态系统中能量流动和物质循环等方面起着重要作用(Steven et al.,2003)。然而,长期以来,与根际微生物研究相比,叶际微生物研究相对较少,叶际微生物群落功能方面的研究就更少。本研究在前期对臭氧浓度升高下的转 Bt 基因水稻及常规水稻叶面微生物群落数量和结构多样性研究的基础上,对臭氧浓度升高下的水稻叶面微生物功能多样性进行了研究,以期在功能效应上阐述农田生态系统中叶面微生物群落对臭氧浓度升高的响应。平均吸光值 (AWCD) 是反映微生物群落总体活性的一个重要指标,在一定程度上反映了环境中微生物种群的数量和结构特征,接种液中含有的微生物种类和数量越多,则微孔板中能被利用的碳源种类越多且利用程度越高。分析 2010年和 2011 年不同采样时期 Elevated O3和 Ambient 下转基因水稻 Bt-SY63 和常规水稻 SY63 叶面微生物 AWCD 的变化发现(图 7-1 和图 7-2),2010 年和 2011 年,无论 Ambient 下还是臭氧浓度升高下,Bt-SY63 和 SY63 叶面微生物群落 24h 内AWCD 均较低,表明 Biolog ECO 板上的碳源基质基本未被利用。

………….


结论


近地层臭氧(O3)浓度的快速上升给世界范围内的农作物造成了严重损失。水稻是世界范围消费性食物中最重要的粮食作物,也是 O3敏感型植物。“Bt 汕优 63”是我国农业部 2009 年依法批准发放生产应用安全证书的一个转基因抗虫水稻品种,其在未来 O3浓度升高条件下的生理生态风险值得关注,研究 O3臭氧浓度升高下转 Bt 基因水稻的形态结构、生理生化特性响应以及由此而波及的环境微生物的变化,对于评估我国近地表 O3浓度快速增长前景下的转基因水稻臭氧生态风险具有重要的现实意义和应用价值。本研究以江苏省江都小纪镇世界上首个稻麦农田轮作生态系统上的开放式O3浓度升高(O3-FACE)试验平台为研究基地,模拟 2030 年前后我国东部近地表 O3浓度条件,在水稻生长的抽穗期、灌浆后期和成熟期,研究了盆栽转 Bt基因水稻 Bt 汕优 63 (Bt-SY63)及常规水稻汕优 63(SY63)叶片表面和内部超微结构,以及两基因型水稻叶、茎和根各组织中的可溶性蛋白含量和可溶性总糖含量对臭氧浓度升高的响应。于水稻生长的分蘖期、抽穗期和灌浆后期分别采集盆栽水稻根际表层土壤(0~15 cm)和水稻叶片,连续两年研究和比较了臭氧浓度升高下和自然条件(Ambient)下 Bt-SY63 和 SY63 水稻根际土壤中和叶表面可培养微生物数量、微生物群落多样性(仅土壤)、土壤细菌总数量、细菌群落结构多样性(土壤和叶面)、微生物群落代谢功能多样性(土壤和叶面)的变化。以不同时期的水稻叶片为试验材料,研究分析了臭氧浓度升高下的转 Bt 基因水稻 Bt基因的 mRNA 表达水平上的变化,并探讨臭氧浓度升高下其与 Bt 蛋白表达的关系。
…………
参考文献(略)

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